A malária é um sério problema de saúde mundial. Anualmente, são infectados 200 milhões de pessoas e 2 milhões morrem da doença. Apesar do aumento do número de terapias e métodos de controle, continuamos longe de controlar a doença. A chave para a redução da taxa de mortalidade é um diagnóstico rápido e uma terapia eficaz. Apesar da microscopia ser considerada o padrão-ouro para o diagnóstico e monitoramento do tratamento da malária, essa técnica exige pessoal treinado e experimentado no exame de distensões sanguineas. Novas técnicas científicas estão sendo empregadas para desenvolver diagnósticos simples, eficazes, capazes de serem realizados fora do laboratório. Espera-se que a utilização desses testes venha a possibilitar diagnósticos rápidos nas comunidades locais, assegurando o tratamento imediato e eficaz para prevenir a disseminação da doença.
A malária infecta mais de 200 milhões de pessoas no mundo, dos quais morrem 2 milhões. Um diagnóstico rápido e o tratamento precoce dos casos clínicos é essencial para a redução da taxa de mortalidade por malária. O monitoramento da eficácia do tratamento antimalárico é igualmente decisivo. Isso exige controle da eliminação dos parasitas para que se possa detectar precocemente qualquer recrudescimento da doença devido às variedades resistentes aos medicamentos, iniciando-se um tratamento igualmente precoce com vistas a prevenir complicações e deter a propagação da doença. O atraso no diagnóstico e a demora no tratamento são os motivos por que se associa essa elevadíssima taxa de mortalidade à malária do P.falciparum. O problema é ainda mais agravado pela redução da sensibilidade às drogas pelo parasita da malária, particularmente o P.falciparum, e pelo aumento na transmissão da malária em algumas regiões do mundo, enquanto escasseiam as medidas para controle do vetor e sua resistência aos pesticidas. Atualmente, o P.falciparum é virtualmente intratável pela cloroquina na maior parte do mundo. Muitas variedades do P. vivax também são resistentes à droga. O quinino é a droga preferida para o tratamento da malária resistente a cloroquina, mas a toxicidade da mesma e o não seguimento da prescrição médica são problemas que persistem. Novas drogas antimalária (e.g. Artenusate, Malarone, Mefloquine) são caras e nem sempre eficazes. Já existe alguma resistência a essas novas drogas.
Diagnóstico da malária no laboratório
A administração eficaz de um caso de malária exige o diagnóstico imediato, seguido do tratamento precoce apropriado. O tratamento com drogas deve ser monitorado para assegurar a detecção precoce de quaisquer falhas no tratamento que possam resultar em complicações e na propagação continuada de variedades resistentes às drogas. Deve-se então escolher um tratamento alternativo. É mundialmente aceita a necessidade de diagnosticar melhor a malária. O teste ideal para o diagnóstico da malária deve ser simples, rápido, de fácil interpretação, sensível (capaz de detectar níveis bastante baixos de parasitemia, e.g. numa população imune em áreas endêmicas, em infecções subpatentes e recrudescentes), e específico, particularmente quanto ao P. falciparum. O teste deve ser adequado para uso em espécimes frescos ou preservados (desidratados ou congelados), e possivelmente formatado para uso em equipamentos automáticos de análises clínicas. Também deve ser possível a obtenção de resultados quantitativos (parasitemia) para o monitoramento do tratamento por drogas. Qualquer teste disponível deve ser de baixo custo para uso em áreas endêmicas onde a doença prevalece.
Microscopia de distensão sanguínea
Historicamente, a pedra fundamental para o diagnóstico da malária tem sido a microscopia de distensões sanguíneas espessas e finas. Essa técnica continua sendo o método mais econômico e, independente do progresso que se está alcançando com métodos não-microscópicos para o diagnóstico da malária, a microscopia continuará sendo por muitos anos uma importante técnica diagnóstica. O diagnóstico microscópico é um procedimento sensível, de custo reduzido, que pode fornecer informações valiosas ao médico atendente, tanto para fins terapêuticos como para o acompanhamento clínico. O treinamento de um microscopista no reconhecimento e identificação de espécies de parasitas da malária, assim como para contribuir com informações capazes de influenciar o modo de aplicação e a droga a ser ministrada, é uma tarefa muito exigente, que requer empenho, paciência e habilidade. A microscopia não deve ser desprezada ainda que outros métodos não-microscópicos estejam disponíveis.
Microscopia de distensão sanguínea
Historicamente, a pedra fundamental para o diagnóstico da malária tem sido a microscopia de distensões sanguíneas espessas e finas. Essa técnica continua sendo o método mais econômico e, independente do progresso que se está alcançando com métodos não-microscópicos para o diagnóstico da malária, a microscopia continuará sendo por muitos anos uma importante técnica diagnóstica. O diagnóstico microscópico é um procedimento sensível, de custo reduzido, que pode fornecer informações valiosas ao médico atendente, tanto para fins terapêuticos como para o acompanhamento clínico. O treinamento de um microscopista no reconhecimento e identificação de espécies de parasitas da malária, assim como para contribuir com informações capazes de influenciar o modo de aplicação e a droga a ser ministrada, é uma tarefa muito exigente, que requer empenho, paciência e habilidade. A microscopia não deve ser desprezada ainda que outros métodos não-microscópicos estejam disponíveis.
Distensão sanguínea ‘espessa’ (gota espessa)
A distensão sanguínea espessa proporciona uma camada de 3 a 5m l de sangue numa área de 1 cm2. É corada com corante não fixado de Fields ou Giemsa (Romanowsky). Uma distensão espessa é 15 a 20 vezes mais sensível do que a distensão sanguínea fina equivalente e responde pela sensibilidade da técnica microscópica. Nas mãos de um microscopista experiente, uma densidade de parasitas da ordem de 5 a 50 parasitas/m l (0,001%-0,0001% parasitemia) pode ser detectada. No entanto, pela experiência da UKNEQAS [United Kingdom National External Quality Assessment/Avaliação Nacional da Qualidade Externa no Reino Unido] para Parasitologia, um nível de 50 a 500 parasitas/m l (0.01-0.001%) é mais realista para a maioria dos laboratórios. O exame de 200 campos de distensão sanguínea espessa é o método padrão, e o seu uso pode acelerar a rapidez no diagnóstico e melhorar a sensibilidade de detecção do parasita em várias casas decimais, em comparação com distensões sanguíneas finas. A microscopia que utiliza distensões sanguíneas espessas pode ser empregada para diagnóstico e triagem de estágios de gametas. Adicionalmente, a maior sensibilidade da distensão sanguínea espessa permite detectar quaisquer indícios iniciais de alterações na morfologia parasitária ou a falha em erradicar o parasita após uma terapia adequada, o que pode sugerir uma possível resistência à droga ou o recrudescimento da infecção.
Distensão sanguínea ‘fina’
As distensões sanguíneas finas produzem uma monocamada de eritrócitos na lâmina e são coradas com corante Giemsa após a fixação. A distensão fina possui elevada especificidade e o reconhecimento preciso do estágio do parasita da malária, permitindo determinar sua espécie. Relatar o número de hemácias (RBCs) parasitadas pelo P. falciparum (parasitemia) é uma outra ferramenta que permite ao médico decidir sobre a severidade potencial da infecção, particularmente em pacientes não-imunes, e influencia a escolha da droga e a via de administração. O exame correto de uma distensão sanguínea fina que tenha sido corado leva pelo menos 20 minutos. O reconhecimento e relato dos estágios mais tardios do trofozoíto do P. falciparum podem fornecer indicadores valiosos para o clínico sobre um possível envolvimento cerebral.
Os trofozoítos tardios do P.falciparum contém cromatina expandida e um citoplasma mais espesso que é freqüentemente vacuolado (figura 1). Inclusões de hemácias (fenda de Maurer [Maurer’s cleft]) também são visíveis. Adicionalmente, um pequeno aglomerado de pigmento marrom dourado de hemozoína é encontrado em posição oposta ao único ponto de cromatina do núcleo. Os estágios esquizontes do P.falciparum são identificáveis pela divisão da cromatina em diversas partes e uma massa única e grande de pigmento hemozoína. As hemácias parasitadas são muitas vezes ‘desemoglobinizadas’. O exame diário de distensões sanguíneas finas para a verificação de parasitemia fornece valiosa indicação de terapia bem sucedida ou de possível fracasso na terapia medicamentosa.
Parasitas inviáveis podem permanecer em circulação junto com parasitas viáveis e poderiam, portanto, estar presentes numa parasitemia. Tem sido relatada a diferenciação por fluorocromos entre parasitas viáveis e inviáveis com Rhodamine 123. O laranja acridina e o Benzociocarboxipurina são dois fluorocrômos que têm afinidade com a cromatina do núcleo do parasita, e têm sido empregados nos procedimentos de coloração de parasitas da malária com uso de uma fonte de luz UV. Eles constituem um método microscópico sensível para a detecção de parasitas da malária, mas carecem da capacidade de especificar. O controle da qualidade de todos os corantes e procedimentos de coloração é boa prática de laboratório.
Testes baseados em antígenos
Toda técnica empregada no diagnóstico da malária deve atender a determinados critérios técnicos e igualar, ou exceder, o desempenho do método atualmente aprovado (O Padrão-Ouro). Deve ser sensível, precisa e fácil, exigindo pouco treinamento do operador e da capacidade de interpretar. Para substituir um procedimento aprovado por um método novo, é necessário que este forneça aos médicos resultados igualmente aceitáveis.
Os Testes de Diagnóstico Rápido (TDRs) que fazem uso do princípio da imunocromatografia estão se tornando uma alternativa viável para o exame microscópico de distensões sanguíneas finas/espessas (figura 2). Os testes atuais disponíveis para malária empregam antígenos de três parasitas detectáveis distintos: Histidine Rich Protein 2 é um antígeno do P. falciparum encontrado em abundância. Também são usados o lactato dehidrogenase e a aldolase parasita-específicos. Um terceiro componente é usado no BINAX ‘NOW’ ICT, mas ainda não foi divulgado.
O que podem fazer os TDRs atuais?
Os atuais TDRs podem ser utilizados. com sensibilidades variáveis, para detectar o P.falciparum isolado ou o P.falciparum com ‘outros’ antígenos da espécie Plasmodium. Todos dão um resultado em prazo compatível (20 minutos) e não há correlação direta entre a densidade visual da linha de captura e a parasitemia calculada a partir da distensão sanguínea fina. Os TDRs que usam o HRP2 para o reconhecimento do P falciparum não distinguem entre antígenos de parasitas viáveis e inviáveis em circulação. Contudo, os TDRs que medem a atividade enzimática do parasita indicam a presença de parasitas viáveis exclusivamente.
PCR – uma alternativa válida para o diagnóstico da malária?
Foram desenvolvidos numerosos ensaios baseados em PCR (Polymerase Chain Reaction/Reação em cadeia de polimerase) para o diagnóstico da malária. Vários estudos demonstram que a PCR tem sensibilidade e especificidade maiores do que a distensão sanguínea fina (figura 3). A técnica é muito útil quando há necessidade de examinar com precisão um grande número de amostras como, por exemplo, em diversos estudos epidemiológicos; em experiências clínicas, terapêuticas e de imunização; na triagem de doadores de sangue e na detecção de vetores assintomáticos em áreas endêmicas. A PCR é também uma ferramenta muito útil no diagnóstico de infecções mistas, no monitoramento da resposta do paciente a drogas antimalária, e na caracterização de genótipos.
Numerosos alvos de DNA têm sido empregados em ensaios baseados em PCR. A pequena subunidade de gene (SSU) rRNA, com seus sítios gene-específicos e espécie-específicos, tem sido empregada na diferenciação de espécies plasmodiais de PCR (Snounou et al 1996). Também têm sido investigadas as regiões espécie-específicas do gene da proteína ‘circumsporozoíta’.
A PCR também está se tornando uma ferramenta cada vez mais importante no monitoramento do tratamento medicamentoso. Os métodos que dependem de testes de suscetibilidade in vitro são de emprego limitado porque exigem equipamentos e perícias consideráveis, e com freqüência produzem resultados inconsistentes. Nem todos os parasitas podem ser adaptados à cultura in vitro, e os métodos microscópicos não são suficientemente sensíveis para detectar níveis muitos baixos de parasitemias resultantes de tratamentos curativos ou subterapêuticos (parasitemias subpatentes ou infecções recrudescentes).
Automatização usando pigmento Hemozoína
O pigmento hemozoína é produzido pelo parasita da malária ao digerir a hemoglobina do eritrócito. O seu uso como possível alvo para diagnóstico com o emprego de gráficos de dispersão produzidos por analisadores de contagem sanguínea tem sido discutido, (Parasitology Today, vol. 16, 2000). A possível presença contínua do pigmento hemozoína nos monócitos por períodos consideráveis após a cura originam diagnósticos falso-positivos, em particular nas áreas endêmicas. Contudo, esta será uma área interessante para desenvolvimento futuro.
Conclusão
A distensão sanguínea corada ainda é de uso extensivo e prático no diagnóstico de rotina da malária e atualmente não pode ser superado como o padrão-ouro para diagnóstico. Contudo, alguns TDRs podem proporcionar a sensibilidade e a especificidade necessárias para substituir a microscopia, assim que tiverem sido vencidos os problemas de estabilidade e custo. Espera-se que, eventualmente, todo centro de saúde possa diagnosticar a malária, ensejando o diagnóstico e o início de tratamento eficaz precoces. Isso terá um papel vital na redução do número de óbitos por esta doença.
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